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    公开号:WO1991016341A1
    申请号:PCT/JP1990/000513
    申请日:1990-04-19
    公开日:1991-10-31
    发明作者:Tatsuhiko Kanmera；Akihisa Mori；Yoshihide Nakao；Kenichiro Nakao
    申请人:Mitsubishi Kasei Corporation；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] [発明の名称]
    [0003] ぺプチド誘導体
    [0004] [技術分野]
    [0005] 本発明は、 新規なペプチド誘導体に関する。 詳しくは新規な副甲状 腺ホルモンアンタゴニス トに関する。
    [0006] [背景技術]
    [0007] 副甲状腺ホルモン（以下 PTHと略す）は骨、 カルシゥム代謝に関与す る 84アミノ酸残基よ りなるぺプチド性ホルモンである。 その N末端 側 34ァミ ノ酸残基からなるペプチドフラグメ ン ト （PTH (1 -34) )は PTHと同様の作用を有する。 さらに、 ΡΊΉ (1 - 34)のァミノ末端数残 基を欠く フラグメ ン ト （PTH (3 - 34)、 PTH (7 - 34)やその誘導体）は PTHの作用を制御することが知られている。
    [0008] また、 最近、 ヒ トの癌由来で、 PTHと類似した作用を持つ PTH関連 ぺプチド（PTHrPと略す）の構造決定がなされた（スバ（Suva)ら、 サイ エンス （Science)第 237卷、 893 (1987) )。 ヒ ト PTHrPは 141個のァミ ノ 酸よ り成るポリペプチドで、 その PTHと類似した生物活性、 すなわ ち、 血中カルシウムの上昇、 骨吸収促進、 血中リ ン低下、 尿中カルシ ゥムの低下、 尿中 cAMPの増加、 腎臓でのビタ ミ ン Dの 1位水酸化酵 素の活性化などを有することが最近報告された（ホリ ゥチら、 サイエ - - ンス （Science)、 第 238卷、 1988； ケ ン プ（Kemp) ら、 サイ エ ンス (Science)、 第 238巻、 1988)。
    [0009] PTHrPはアミノ末端側の一部の構造が PTHと類似するものの、 その 一次構造の類似性は少ない。 それにも関わらず PTH同様ァミノ末端数 残基を欠損するフラグメ ン ト （PTHrP (3 - 34) )は PTHの作用を抑制す る （ラバニ（Habbani)ら、 アメ リ カ骨代謝学会発表、 1988)。
    [0010] 以下のように、 PTH拮抗作用を有するものとしては PTH誘導体であ る [Tyr 34] -liPTH (3 - 34) -NH2及び PTHrP誘導体の hPTHrP (3 - 34) - NH2が公知であるが、 これらと比較してより強い PTH拮抗作用を有す るものが求められていた。
    [0011] [癸明の開示]
    [0012] 本癸明は、 下記式（I )
    [0013] Leu一 Met一 His一 Asn - Leu一 Gly一 Lys一 Ser一 lie - Gin一 Asp - Leu 一 Arg一 Arg - Arg一 Phe - Phe一 Leu - His一 His一 Leu一 lie一 Ala一 Glu -Ile …… ( I ) で表わされるぺプチド配列を含有する全ァミノ酸残基数が 25 - 50の ペプチド、 そのアミ ドまたはそれらの塩に関する。
    [0014] 尚、 本明細書に記載の略号は次の意味を有する。
    [0015] Asp Lーァスパラギン酸
    [0016] Thr L - ト レオニン
    [0017] Ser Lーセリ ン Asn Lーァスパラギン
    [0018] Gin L一グルタ ミ ン
    [0019] Glu ； L -グルタ ミ ン酉 i jt
    [0020] Gly Lーグリ シン
    [0021] Ala Lーァラニ ン
    [0022] Met L一メチォニン
    [0023] l i e L一イ ソロイシン
    [0024] Leu L一口イシン
    [0025] Phe L一フエ二ルァラニン
    [0026] Lys L -リ ジン
    [0027] His L—ヒスチジン
    [0028] Arg L-アルギニン
    [0029] Boc tーブトキシカルボニル
    [0030] Z ベンジルォキシカルボニル
    [0031] OcHx シク口へキシルエステル
    [0032] OBzl ベンジルエステル
    [0033] Bzl ベンジル
    [0034] Tos p一トルエンスルホニル
    [0035] Cl -Z 2 -クロ口べンジルォキシカルボニル
    [0036] 以下、 本発明を説明するに、 本癸明のペプチド誘導体は、 少なく と も前記式（I )で表わされるペプチド配列を含有する。 例えば、 下記一 般式（II ) X - Leu - Met一 His一 Asn一 Leu一 Gly - Lys一 Ser - lie - Gin一 Asp一 Leu一 Arg一 Arg一 Arg一 Phe一 P e一 Leu一 His一 His一 Leu一 lie一 Ala 1 - Glu - lie - Y-Z …… (II) において、 1
    [0037] Φ
    [0038] Xとしては Η、 Η— Gin—、 H— A— Gln—、 H— Glu— A— Gin—、 あるい は Ser-Glu-A-Gln- (ここで Aは Ile、 Thr、 Val、 Leuである）等が 挙げられ、
    [0039] Yと しては His— Thr— Ala、 His— Thr— Ala - Glu— lie— Arg— Ala、
    [0040] His - Thr - Ala - Glu - lie - Arg - Ala - Thr - Ser - Glu - Val 、 His -
    [0041] Thr - Ala - Glu - lie - Arg - Ala -Thr- Ser - Glu -Val -Ser- Pro - Asn 一 Ser一 Lys一 Pro一 Asn等 げられ、
    [0042] ヒしては OHあるいは ΝΗ2等が挙げられる。
    [0043] 更に具体的には下記表 1に示すようなぺプチドが挙げられる。
    [0044] X一 Leu一 Met一 His一 Asn一 Leu一 Gly一 Lys一 Ser一 lie - Gin一 ASO L·evL一 Arg一 Arg一 Arg一 Phe一 Phe - heu - His一 nis一 Leu一 He Ala— Glu— lie— Y— Z 化合物
    [0045] X Y Z
    [0046] No.
    [0047] 1 H - Ser - Glu - lie - Gin His -Thr -Ala NH2
    [0048] 2 His -Thr -Ala 跳
    [0049] 3 H - lie - Gin His -Thr -Ala NH2 表 1の続き
    [0050]
    [0051] また、 これらペプチド誘導体は塩酸塩、 酢酸塩などの薬理学的に許 容される塩として利用され得る。 本発明の PTHrP誘導体は式（I )ある いは式（II )で示されるァミノ酸の順序に、 各々保護されたァミ ノ酸 を、 一般的に行われているペプチド固相合成法に従い、 C末端側から 縮合を繰り返すことによ り保護ペプチドを得、 さらに酸分解、 ァミノ リシスなどの既知手段により保護基、 及び担体を除去することにより 得られる。 このようなべプチドの合成法および使用され得る原料ァミ ノ酸誘導体は数多くの参考書に詳しく述べられているにぺプチド合 成の基礎と実際"泉屋ら著、 丸善、 1985 ; "ザ.ぺプチデス （The Peptides)，，、 グロス（Gross)及びマイエンホッ フ ァ一（Meienhofer)共 編、 第 2巻、 アカデミ ックプレス（Academic Press)、 1980 ]。
    [0052] 本発明のぺプチドの合成に用いられる固相担体は通常べプチド合成 で使用されるものであり、 例えば、 置換ベンジル型ポリスチレン樹 脂、 ヒ ドロキシメチルフエ二ル齚酸アミ ド型ポリスチレン樹脂、 置換 ベンズヒ ドリルポリスチレン樹脂、 あるいはぺプチドとの結合基を有 するポリアクリルアミ ド系樹脂である。 ァミノ酸の縮合法は通常ぺプ チド合成で使用される方法、 例えば、 ジシクロへキシルカルボジイミ ド（DCC)法、 酸無水物法、 活性エステル法などを使用することができ る。 本べプチドの原料として使用される保護ァミノ酸の保護基はぺプ チド合成において既知のもの、 従って、 酸分解、 還元、 アミノリシス のような既知の手段によって容易に除去できるものが用いられる。 例 えばァミノ基における保護基としてはホルミル基； トリフルォロアセ チル基；ベンジルォキシカルボニル基、 （オルト一、 またはパラー）ク ロロべンジルォキシカルボニル基、 （オルト一、 またはパラー）ブロモ ベンジルォキシカルボニル基等の置換べンジルォキシカルボニル基； tーブトキシカルボニル基、 t-ァミルォキシカルボニル基等の脂肪族 ォキシ力ルボニル基等が挙げられる。 力ルボキシル基はエステル基に より保護され、 例えば、 ベンジルエステル基、 メ トキシベンジルエス テル基等の置換べンジルエステル基；シク口へキシルエステル基、 シ クロへプチルエステル基、 t -ブチルエステル基等のアルキルエステ ル基等が用いられる。 グァニジノ基は無保護のまま、 あるいはニ トロ 基； トシル基、 メ トキシベンゼンスルホニル基、 メ シチレンスルホニ ル基等のァリルスルホニル基で保護して用いる。 ィ ミダゾール保護基 としては、 トシル基、 ベンジル基、 ジニトロフエニル基等が用いられ る。 セリンおよびトレオニンにおけるヒ ドロキシル基は、 無保護ある いはべンジル基、 置換ベンジル基等で保護される。 トリブトファンに おけるィンドール基は無保護のままあるいはホルミル基等で保護した ものを用いる。 ぺプチドの最終的な脱保護基及び支持体からの遊離 は、 例えば、 様々なスカベンジャーを含む無水フッ化水素により行わ れる。 スカベンジャーとしては通常べプチド合成に使用されるもの、 例えばァニソ一ル、 （オルト一， メタ一， またはパラー）クレゾ一ル、 ジメチルスルフィ ド、 チォクレゾール、 エタンジチオール、 メルカプ トビリジン等が使用される。 ペプチドの精製には、 一般的に使われる ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィー、 高圧及び低圧の逆相クロ マトグラフィ一が適している。 精製されたペプチドは、 酢酸水溶液、 或いは、 塩酸水溶液で平衡化されたゲルク口マトグラフィ一によ り 目 的とする塩に変換することができる。
    [0053] [癸明を実施するための最良の形態]
    [0054] 以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本癸明は これらに限定されるものではない。 実施例 1
    [0055] Ser一 Glu - lie - Gin - Leu一 Met - His一 Asn― Leu - Gly一 Lys - Ser 一 lie一 Gin一 Asp一 Leu - Arg一 Arg一 Arg - Phe一 P e一 Leu一 His一 His - Leu - lie - Ala - Glu - lie - His - Thr - Ala - NH2 (表 1中のィ匕 合物 No. 1)の合成 本ぺプチドは通常の固相合成法に従い、 1 %架橋 4 -メチルベンズヒ ドリルァミ ンポリスチレン固相担体（ァミノ基含量 0.5 mmol )上で合 成した。 本べプチドの合成に使用したァミノ酸誘導体は以下の通り である。
    [0056] Boc - Ala、 Boc - Asp (OcHx)、 Boc - Asn、 Boc - Arg (Tos)、 Boc - Gly , Boc - Gl (OcHx) , Boc - Gin、 Boc - His (Tos)、 Boc - lie、 Boc - Leu . Boc - Lys (CI - Z)、 Boc - Met、 Boc - Phe、 Boc - Ser (Bzl)、 Boc - Thr (Bzl), Boc— Val。 ぺプチド鎖の延長は下記表 2に示した操作の繰り返しにより行った。 表 2
    [0057] 処 理 法 処理回数 時間（分） 脱保護 ぐ第 1処理〉
    [0058] 1.塩化メチレンで洗浄 1 1.0
    [0059] 2. 50%ト リ フルォロ酢酸/塩化メチレン 1 5.0
    [0060] で洗浄
    [0061] 3. 50%トリフルォロ酢酸/塩化メチレン 1 25
    [0062] で脱保護
    [0063] 4.塩化メチレンで洗浄 1 1.0 表 2の続き
    [0064]
    [0065] * Boc - Asn、 Boc- Gln , Boc - Arg (Tos)については DCC / HOBt法 (モジュソブ（Mojsov)ら、 ジャーナル .ォブ.オーガニックケミス ト リ—（J. Org. Chem.)、 45、 555 (1980) )で行つた。
    [0066] ** 予め、 DCCと当該保護アミノ酸を混合することによ り精製した対 称酸無水物を単離することなしに使用した。
    [0067] 支持体及び保護基の除去は既知の HF法により行った。 さらに詳し く は、 保護べプチ ドポリスチレンを 10%パラ -ク レゾール、 65%ジ メチルスルフィ ド及び 25%無水フッ化水素（20 ml )で 0。Cで 2時間反 応後、 反応液を減圧除去し、 さらに 5%パラ -ク レゾ一ル及び 95%無 水フッ化水素（20 ml )で 0°Cで 1時間処理した。 反応液を減圧除去し た後、 齚酸ェチルで洗浄、 1M酷酸で抽出し、 凍結乾燥により粗ぺプ チドを得た。 粗べプチドは逆相高速液体ク口マ トグラフィーにかけ .1% トリフルォロ酢酸を含む水-ァセトニトリルの直線濃度勾配に より溶出した。 凍結乾燥後、 さらに 10mM酢酸アンモニゥム（pH6.0) 中の CMトョパール 650SCL5 X 30 cm)にかけ、 20 mM- 1.0 M酢酸ナ トリ ゥムの直線イオン濃度勾配によ り分離精製した。 目的物を含むフ ラタシヨ ンをさらに 2%酢酸で平衡化したセフアデッ クス G25 L.5 X 50cm)でゲル濾過し、 凍結乾燥後、 前述したゲル濾過によ り酢酸塩 に変換し純粋な上記目的物を得た。
    [0068] 収量： 31 mg
    [0069] アミノ酸分析： 5.5M塩酸中、 110°Cで 48時間加水分解したものをァ ミノ酸分析系で定量。
    [0070] ( )内は理論値。 加水分解中のアミノ酸の分解に対する補正は行って いない。
    [0071] Asp 1.93 (2)、 Thr 0.96 (1)、 Ser 1.56 (2)、 Glu 4.07 (4)、 Gly 0.94 (1)、 Ala 2.01 (2)、 Met 0.91 (1)、 lie 3.84 (4)、 Leu 5.19 (5)、 Phe 1.94 (2)、 Lys 0.95 (1)、 His 3.85 (4)、 Arg 3.13 (3)
    [0072] 旋光度 [ a ]| ： -66° (C = 0.24、 1M酢酸） 実施例 2
    [0073] lie一 Gin - Leu一 Met一 His一 Asn一 Leu― Gly一 Lys一 Ser - lie - Gin一 Asp - Leu一 Arg一 Arg - Arg一 Phe - Phe一 Leu一 His一 nis一 Leu一 He - Ala - Glu - He - His - Thr - Ala - NH2 (表 1中の化合物 No.3)の 合成 上記のぺプチドを実施例 1と同様の方法で合成した。
    [0074] 旋光度 [ ot 5 : - 65° (C = 0·1、 1M酢酸） 実施例 3
    [0075] Leu一 Met - His一 Asn一 Leu一 Gly一 Lys一 Ser一 lie - Gin一 Asp一 Leu 一 Arg一 Arg一 Arg一 Phe一 Phe一 Leu一 His一 His一 Leu一 lie一 Ala一
    [0076] Glu - lie - His - Thr - Ala - NH2 (表 1中の化合物 No. 5)の合成 上記のぺプチドを実施例 1と同様の方法で合成した。
    [0077] 旋光度 [ a ]2 ：—62。 (C = 0.1、 1M酢酸） 実施例 4
    [0078] Ser - Glu - lie - Gin一 Leu - Met - His一 Asn一 Leu一 Gly - Lys一 Ser
    [0079] - lie - Gin一 Asp一 Leu - Arg - Arg一 Arg - Phe - Phe - Leu一 His一
    [0080] His - Leu - lie - Ala一 Glu - lie - His - Thr - Ala - Glu - lie - Ar -
    [0081] Ala - NH2 (表 1中の化合物 No. 7)の合成
    [0082] 上記のぺプチドを実施例 1と同様の方法で合成した。
    [0083] 旋光度 [ α ]i ： - 95。（C = 0.13、 1M酢酸） 試験例
    [0084] ΡΊΉ拮抗作用の測定
    [0085] (方法）
    [0086] マウス由来の培養骨芽細胞 MC3T3 - E1を用いて、 cAMP産生量を指 標として本発明のぺプチド誘導体の PTH拮抗作用を測定した。
    [0087] 培養細胞 を 12穴の マ ルチ ウ エ ル カ ル チ ャ ー プ レ ー ト（ multiwellculture plate )に 1 X 105細胞 /穴で播種し、 10%ゥシ準胎児 血清を含む α-モディ ファイ ド MEMを培地と して、 37°C、 95% air - 5%C02の条件下、 3日間培養した。 次いで 1%ゥシ血清アルブミ ンを 含む α-モディ ファイ ド MEMに培地交換して 6時間ィ.ンキュベー ト し た後、 種々の濃度の本発明化合物と 5X10-9Mの hPTHひ- 34)、 1% ゥシ血清アルブミ ン及ぴ lmMィソブチルメチルキサンチンを含む α -モディフアイ ド MEMに培地を換え、 さらにィンキュ一ベートした。 1時間後、 培地及び細胞を分取し、 培地はそのまま cAMP測定試料と し、 細胞はャマグチらの方法（ジヤーナル 'ォブ.バイオロジカル .ケ ミストリ一（J. Biol. Chem. ) 262 , 7711-7718 (1987)に従い、 90%η - プロピルアルコールで cAMPを抽出して試料を調製した。 cAMP測定 は、 市販の cAMP -ラジオィムノアッセィキッ トを使用して行った。 5 X 10-9Mの hPTH(l-34)によ り生産される cAMP量を 100%と し て、 本癸明化合物による cAMP生産量の 50%阻害率（IC50)を下記表 3 に示した。
    [0088] 尚、 比較対照物質としては、 従来から PTHの拮抗物質として知られ ている [ 3：34]-111>1¾(3-34)-：^112及び11 111¾^(3-34)-：^ を用 いた。 表 3
    [0089]
    [0090] (結果）
    [0091] 上記表 3に示すように MC3T3-E1においては、 例えば本発明の化 合物 1は [Tyr34]-liPTH(3- 34)-ΝΗ2の 140分の 1以下の濃度で 50% 阻害を示し、 hPTHrP (3 - 34) - ΝΗ2の約 12分の 1の濃度で 50%阻害
    [0092] ¾尔した。
    [0093] [産業上の利用可能性〗
    [0094] 本発明のぺプチド誘導体は従来のものに比べ、 hPTHに対して強い 阻害活性を有しており、 高カルシウム血症、 骨粗鬆症等のカルシゥ ム、 リ ン酸の関与する代謝疾患に対する治療薬と して、 あるいは、 PTH及び PTHrPの関与する疾患に対する有用性が期待される。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. 下記式（I)
    Leu一 Met一 His一 Asn― Leu - Gly - Lys一 Ser一 lie - Gin - ASD - Leu 一 Arg一 Arg一 Arg一 Phe - Phe一 Leu一 His - His - Leu - lie - Ala一 Glu-Ile …… (I) で表わされるぺプチド配列を含有する全ァミノ酸残基数が 25-50の ペプチド、 そのアミ ドまたはそれらの塩。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
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    法律状态:
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    1997-07-09| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1990906343 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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    DE69031038T| DE69031038T2|1990-04-12|1990-04-19|Peptidderivate|
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